2D-DIGE

Wieviel Protein benötige ich für eine 2D-Gel?

Das unter anderem am Molecular Proteomics Laboratory eingesetzte 2D-DIGE-System (Sättigungsmarkierung und Minimal-Markierung) erlaubt die Analyse von mindestens 1 µg bzw. 50 µg. Das heißt zum Beispiel, dass mit der DIGE-Sättigungsmarkierung 1000-5000 Zellen (humanes Gewebe) quantitativ analysiert werden können. Die routinemäßig eingesetzte DIGE-Minimal-Markierung erlaubt ohne weitere Optimierungsversuche die Analyse von 50 µg Protein eines Gesamtzelllysates. Für die spätere MS-Analyse nach in-Gel-Verdau sind dann nochmal 200-400 µg Protein notwendig. Das heißt auch hier sollten die Proteinmengen nicht zu knapp bemessen sein.

 

Wie müssen die Proben für ein 2D-Gel vorbereitet sein?

Da bei der isoelektrischen Fokussierung die Proteine zunächst nach ihrer Ladung aufgetrennt sind stören geladene Moleküle wie Salze und ionische Detergenzien. Um die Löslichkeit von Proben zu erhöhen werden daher häufig Zwitterionische Detergenzien (wie CHAPS) eingesetzt. Im Molecular Proteomics Laboratory werden in der Regel Proben verwendet, die eine geringe Salzlast tragen und keine ionischen Detergenzien enthalten. Im standardmäßig verwendeten Puffer (pH8,5) sind 30 mM Tris, 2 M Thioharnstoff, 7 M Harnstoff und 4% CHAPS enthalten. Wichtig ist hier eine gute Qualität der Reagenzien. Oft ist es optimal wenn bereits beim Aufschluss von Gewebe oder Zellen dieser Puffer verwendet wird.

 

Wie lange dauer ein Experiment?

Die Dauer eines Experimentes richtet sich nach seinem Umfang. Für beispielsweise ein 20x30 cm großes Gel müssen zwei Tage Arbeitszeit eingerechnet werden. Diese gliedert sich in: Markierung der Proteine mit Fluoreszenzfarbstoffen (ca. 1h), isoelektrische Fokussierung (ca. 21 h), 2. Dimension SDS PAGE (ca. 5h), scannen der Gele (ca. 1-2 h pro Gel). Das Molecular Proteomics Laboratory hat die Ausstattung um parallel maximal 8 Gele prozessieren zu können. Für die Auswertung müssen weitere 1-2 Tage eingerechnet werden.