Proteinidentifizierung

Welche Färbemethoden der Gelelektrophorese sind kompatibel mit der MS-Analyse?

Eine Vielzahl von Färbemethoden lassen sich mit anschließender MS-Analyse durchführen. Organische Farbstoffe (Coomassie, Sypro Ruby etc.), kovalent gekoppelte Fluoreszenzfarbstoffe (CyDyes, Refraction Dyes etc.), aber auch die Silberfärbung lassen sich mit der MS kombinieren. Allerdings sind entsprechende Färbeprotokolle (erhältlich am Molecular Proteomics Laboratory) und Waschprozeduren einzuhalten. Bei der Silberfärbung ist darauf zu achten das mögliches Quervernetzen (cross linking) durch Form- und Glutaraldehyd vermieden wird.

 

Wieviel Protein benötigt man für eine MS-Identifizierung?

Streng genommen gilt auch für die MS-Analyse der gute Chemikerspruch "viel hilft viel". Allerdings zeigt die Erfahrung, dass für die MS-Analyse in der Regel eine sichtbare Silberbande (1 ng - 10 ng Protein) im SDS-Gel schon erfolgreich identiziert werden kann. Man sollte sich aber bewusst sein, dass für eine vollständige Primärsequenzcharakterisierung (100% Sequenzabdeckung, PTMs etc.) schnell die 5-10-fache Menge notwendig werden kann, da hier eventuell mit unterschiedliche Proteasen und MS-Methoden gearbeitet werden muss.

 

In welcher Form soll ich meine Probe abgeben?

Am besten ist es, das Molecular Proteomics Laboratory möglichst früh in die Experimentplanung miteinzubeziehen. Dann können die Bedingungen für die Probenübergabe abgestimmt und somit die Analysen unter optimalen Bedingungen durchgeführt werden. Es ist streng darauf zu achten, dass keine post-experimentellen und co-analytischen Artefakte generiert werden. So kann zum Besipiel für die Bestimmung von Phosphorylierungsstellen durch Zugabe von Phoshataseinhibitoren darauf geachtet werden, dass keine Phosphatgruppe abgespalten wird und zu unrealistischen Ergebnissen führt. Ferner sollte verhindert werden, dass Proteolyse empfindliche Proteine abgebaut werden. Für die Proteomanalyse gilt es möglich schnell sein Proteome "einzufrieren", dass kann zum einen im wahrsten Sinne des Wortes durch Schockgefrieren geschehen. Wenn dieses nicht möglich/ratsam ist, sollte schnell und kühl gearbeitet werden. Hinzu kommt, dass man eine Verdünnung der Proben verhindern sollte (einige Proteine fallen in verdünnter Lösung aus!!) und den Kontakt mit Haut und Haaren (Keratine!!!) vermeiden sollte.

 

Welche Stoffe dürfen in meiner Proben enthalten bzw. nicht enthalten sein?

Die Probenaufarbeitung mit nicht flüchtigen Salzen, Lösungsmitteln und Detergentien ist unbedingt zu vermeiden. Diese Substanzen behindern die Messung (bei der MALDI-TOF-MS die Kokristallisation von Analyt und Matrix; bei der ESI-MS das Spray-Verhalten) und ergeben häufig auch noch selbst Ionensignale im Sättigungsbereich des Detektors, da sie bereits eine Ladung tragen, oder leicht zu ionisieren sind.
Wenn möglich, benutzen Sie flüchtige Salze wie Ammoniumhydrogencarbonat, Ammoniumacet, Ammoniumformiat, etc.
Flüchtige Lösungsmittel wie Wasser, Methanol, Acetonitril, etc. sind geeignet. Basische Lösungen sind ungeeignet. Säuern Sie Ihre Proben an, wenn es möglich ist. Verwenden Sie dazu Ameisensäure als Mittel der Wahl; ggf. gehen auch Essigsäure oder Triflouressigsäure.
Geben Sie unbedingt die Probenkonzentration und das ungefähre Molekulargewicht des Proteins an! Bei lyophilisierten Proben bitte die Einwaage angeben! Bei gelösten Proben unbedingt das Lösungsmittel angeben!

 

Wie erfolgt ein in-Gel-Verdau?

Die Proteinbanden/-spots werden aus dem Gel sauber ausgeschnitten, für den Verdau gewaschen und umgepuffert und durch Trypsin oder einer anderen Protease im Gel verdaut. Danach werden die entstandenen Peptide aus dem Gel extrahiert und massenspektrometrisch analysiert.