Chromatographie

Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (High performance liquid chromatography, HPLC) stellt eine physikalische Trennmethode in flüssiger Phase dar. Das grundlegende Prinzip der HPLC basiert auf einem Verteilungsgleichgewicht des Analyten zwischen mobiler und stationärer Phase. Im Gegensatz zur LC werden bei der HPLC Säulen mit kleinerem Durchmesser und höheren Pumpendrücken verwendet.

Am Molecular Proteomics Laboratory wird die HPLC als routinemäßige Trennmethode für Peptide vor ihrer massenspektrometrischen Analyse eingesetzt. Bei der direkten Kopplung der Trenn- und Identifizierungsverfahren (LC-MS) werden die eluierenden Peptide direkt in einer Elektrosprayionisationsquelle (ESI) in die Gasphase überführt und nachfolgend identifiziert.

Für verschiedene Analyten und verschiedene Fragestellungen gibt es mittlerweile eine ganze Reihe komplementärer HPLC-Modi, darunter Normalphasenchromatographie (NPC), Umkehrphasenchromatographie (RPC), Ionenaustauscherchromatographie (IEC), Größenausschlusschromatographie (SEC), Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) oder electrostatic repulsion hydophilic interaction chromatography (ERLIC). Routinemäßig wird am MPL die RPC eingesetzt, wobei durch die Verwendung langer Kapillarsäulen (50 cm) mit kleiner Porengröße (3 µm) die Trennung bei einem Fluss von 200-300 nL auch kleinste Probenmengen (<15 µL) erlaubt.

Großer Wert wird hierbei auf die Reproduzierbarkeit gelegt. Regelmäßig wird anhand von Standards unterschiedlicher Komplexität die Performance unserer HPLC-Anlagen überprüft. Auf diese Weise können wir gewährleisten, dass auch umfangreiche Studien ohne chemisches oder metabolisches Labeling quantifiziert werden können.