2D-DIGE

Die zweidimensionale differentielle Gelelektrophorese (2D-DIGE) vereinigt die Vorteile des Fluoreszenz-basierten Nachweises von Proteinen und der Auftrennung von bis zu 10.000 intakten Proteinen mittels klassischer zweidimensionaler Gelelektrophorese (2D-GE). Die kovalente Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen an die Proteine vor der 2D-GE und die Verwendung von bis zu drei Fluoreszenzfarbstoffen erlaubt die parallele Prozessierung von zwei Proben und einen internen Standard (Multiplexing). So können Gel-zu-Gel Variationen minimiert und die Genauigkeit der Quantifizierung erhöht werden. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen erlaubt zudem eine lineare dynamische Quantifizierung über vier Größenordnungen.

Nach der Fluoreszenzmarkierung werden die Proteine mittels isoelektrischer Fokussierung über einen pH-Gradienten nach ihrem isoelektrischen Punkt in einer Gelmatrix aufgetrennt. Anschließend wird das IEF-Gel auf ein SDS-Gel aufgelegt und die Proteine in einer zweiten Dimension nach ihrem Molekulargewicht elektrophoretisch aufgetrennt. Mit der Methode können auch Proteinisoformen wie proteolytisch oder posttranslational modifizierte Varianten aufgelöst werden.

Unterschieden werden können zwei unterschiedliche Verfahren, die sogenannte Minimal- und die Sättigungsmarkierung. Bei der Minimalmarkierung stehen drei verschiedene Farbstoffe zur Verfügung. In der Regel werden 50 µg Probe eingesetzt. Bei dem Einsatz von Minimalmarkierung wird der Fluoreszenzfarbstoff im Unterschuss zugegeben und an Lysine gekoppelt. Insgesamt werden lediglich 2 bis 3% der Proteine - daher auch die Bezeichnung Minimalmarkierung - markiert. Bei der Sättigungsmarkierung stehen zwei verschiedene Farbstoffe zur Verfügung. Normalerweise werden 1 bis 5 µg Protein eingesetzt, die Methode eignet sich also auch für geringe Probenmengen. Die Kopplung der Farbstoffe erfolgt an Cysteine, die möglichst vollständig markiert werden.

 

Literatur

Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts.

Unlü M, Morgan ME, Minden JS. Electrophoresis. 1997 Oct;18(11):2071-7.

 

Difference gel electrophoresis.

Minden JS, Dowd SR, Meyer HE, Stühler K. Electrophoresis. 2009 Jun;30 Suppl 1:S156-61.

 

Application of saturation labeling in lung cancer proteomics.

Poschmann G, Sitek B, Sipos B, Stühler K. Methods Mol Biol. 2012;854:253-67.