SILAC

Das Kürzel SILAC steht für “stable isotope labeling by amino acids in cell culture”. Bei diesem Verfahren werden Proteine metabolisch durch den Einsatz von Aminosäuren markiert, die schwere Isotope enthalten. In der Regel erfolgt die Markierung in Zellkulturen, es lassen sich aber auch die Proteine ganzer Organismen wie Maus oder Drosophila markieren. In der Regel werden Lysin und/oder Arginin für die Markierung eingesetzt und die untersuchten Proteome vor der Analyse verdaut, so dass eine Quantifizierung auf der Ebene von Peptidsignalen im Massenspektrum erfolgt. Peptide, die mit „schweren Aminosäuren“ markiert wurden unterscheiden sich in ihrer Isotopenzusammensetzung, verhalten sich aber während der Probenpräparation, Auftrennung und massenspektrometrischer Analyse wie ihre „leichten“ Gegenstücke. Die relativen Verhältnisse der Peptidsignale im Massenspektrum korrelieren direkt mit dem Verhältnis der zu vergleichenden Peptide aus der Probe. Mit geeigneter Software lassen sich die relevanten Signale extrahieren und Peptidverhältnisse errechnen.

Die metabolische Markierung durch stabile Isotope eröffnet noch einige weitere Möglichkeiten. So lassen sich durch den Einsatz verschiedener Isotope nicht nur zwei sondern auch drei und mehr verschiedenen Proben gleichzeitig in einem LC-MS Lauf analysieren.

Außerdem lassen sich isotopenmarkierte Peptide als „Spike-In“-Standard verwenden und können gemeinsam mit unmarkierten Proben gemessen werden. Dieser Ansatz findet Verwendung wenn Organismen oder anderes Probenmaterial nicht direkt markiert werden kann (z.B. bei primärem Humangewebe). Durch den relativen Bezug zum Standard ist der quantitative Vergleich von mehreren unmarkierten Proben untereinander möglich.

Eine weitere Anwendung ist das sogenannte „Pulsed-Labeling“. Durch die Umstellung des Angebots an isotopenmarkierten Aminosäuren kann auf Ebene von massenspektrometrischen Untersuchung die Synthese und der Umsatz von Protein in Zellen und Organismen analysiert werden.

 

 

 

Literatur

 

Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.

Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M. Mol Cell Proteomics. 2002 May;1(5):376-86.

 

Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics.

Ong SE, Mann M. Methods Mol Biol. 2007;359:37-52.

 

Super-SILAC mix for quantitative proteomics of human tumor tissue.

Geiger T, Cox J, Ostasiewicz P, Wisniewski JR, Mann M. Nat Methods. 2010 May;7(5):383-5.

 

Global analysis of cellular protein translation by pulsed SILAC.

Schwanhäusser B, Gossen M, Dittmar G, Selbach M. Proteomics. 2009 Jan;9(1):205-9.